Extração e análise de ácidos nucleicos na prática
Muita gente começa a trabalhar com ácidos nucleicos achando que é só seguir o protocolo do kit e pronto. A realidade é bem diferente disso. Já vi amostra boa virar sujeira por causa de um detalhe bobo na hora da lise, e já vi amostra ruinzinha render um resultado limpo porque o cara ajustou o pH antes de precipitar. O que segue aqui não é o resumo de um caderno de protocolos. São coisas que aparecem quando você passa tempo suficiente lidando com DNA e RNA de verdade, não só com células cultivadas em placa de Petri. Ácidos nucleicos são sensíveis, sim, mas a sensibilidade varia muito dependendo do tipo de amostra, do método de extração e do que você vai fazer depois com o material.
Ácidos nucleicos: o que realmente importa na hora de trabalhar
A primeira coisa que a maioria dos manuais não conta é que o sucesso da extração depende muito mais do estado da amostra do que do volume dos reagentes. Amostras biológicas frescas são mais previsíveis. Amoras congeladas, tecidos fixados em formol, fezes, sangue velho ou culturas de biofilme são outra história. Cada tipo exige ajuste. DNA e RNA têm comportamentos opostos quando você mexe nas condições. O DNA aguenta bastante abuso. O RNA não aguenta nada. Se o seu objetivo é RNA e você não controla as RNases desde o primeiro segundo de contato com a amostra, o resultado vai se deteriorar antes de você perceber que algo está errado.
Um detalhe técnico que faz diferença real é a concentração de etanol no passo de ligação. Os manuais costumam falar em 70 a 80 por cento, mas a precisão nesse intervalo define se você perde polifenóis junto com o DNA em amostras vegetais ou não. Quando o etanol fica abaixo de 75 por cento, a pureza cai porque os polissacarídeos e os fenólicos voltam a se dissolver e acompanham o ácido nucleico até a coluna. Não é um efeito dramático na primeira extração. É um efeito acumulativo. Na sexta extração da semana, você percebe que o A260/A280 piorou e não consegue entender por quê. Outra coisa que pouca gente leva a sério é o tempo de incubação com proteinase K. O protocolo padrão fala em quinze a trinta minutos a cinqüenta e cinco graus. Isso funciona para culturas bacterianas. Para tecido hepático ou para amostras com muita queratina, como cabelo ou pena, o tempo ideal é o dobro ou mais. Se você cortar esse tempo para economizar, o rendimento pode não mudar visivelmente, mas a presença de proteína residual vai atrapalhar a PCR ou a digestão com enzimas restritivas depois. Eu já perdi duas preparações de DNA genômico para digestão por causa disso. A enzima simplesmente não cortava. Não era a enzima. Era proteína demais.
A precipitação com acetato de sódio e etanol é outro ponto onde os detalhes importam. A concentração final de acetato precisa ser cerca de 0,3 molar. Menos que isso e você perde fragmentos pequenos. Mais que isso e você co-precipita sais que depois dificultam a ressuspensão. O frio em menos vinte graus ajuda, mas o tempo é mais importante que a temperatura. Quatro horas no freezer rende melhor que quinze minutos, especialmente se o volume for maior que um mililitro. Gelo só não resolve. Quando o assunto é RNA, o problema das RNases é sempre o mesmo, mas a solução costuma ser subestimada. Tratar vidraria com dietil pirocarbonato funciona, mas é demorado e deixa resíduo. Um alternativo mais rápido é usar soluções comerciais à base de sodas caústicas para limpeza de bancada e material, seguida de secagem completa e irradiação com ultravioleta por pelo menos dez minutos de cada lado. O UV destrói RNases de superfície. Não resolve contaminação interna de amostras, mas elimina grande parte do problema ambiental. Se você trabalha com RNA regularmente, essa rotina economiza dias de tentativas frustradas.
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Um caso específico que vale mencionar é a extração de DNA de solo. Esse tipo de amostra parece impossível no início. Os ácidos húmicos competem com a ligação do DNA na coluna e inibem reações enzimáticas depois. A abordagem que funciona consistentemente é uma pré-lise com agitacão vigorosa usando esferas de vidro de um milímetro de diâmetro, seguida de centrifugação em gradiente de sacarose para separar os ácidos nucleicos dos componentes do solo. Não é rápido. Leva cerca de duas horas. Mas o DNA sai com pureza suficiente para amplificação direta. Já tentei simplificar usando apenas kit comercial para solo e o resultado era intermitente: às vezes funcionava, às vezes a Inibição era tão forte que até o controle interno da PCR falhava. A técnica manual é mais trabalhosa, mas é previsível. Outro problema recorrente é a degradação por ciclos de congelamento e descongelamento. DNA em solução aquosa sofre cisão mecânica quando cristais de gelo se formam. O mito de que DNA é eterno só vale para amostra seca ou em condições controladas. Em solução, cada ciclo de congelamento e descongelamento destrói cerca de cinco a dez por cento das moléculas longas. Se você trabalha com DNA genômico para bibliotecas de sequenciamento, isso é crítico. A solução é alíquota. Dividir a amostra em volumes menores e nunca mais recongelar o que já foi usado. Isso evita perda de integridade e também evita contaminação cruzada entre usos.
Quanto a medição de concentração e pureza, o espectrofotômetro UV ainda é o padrão, mas ele mente às vezes. Um A260/A280 de 1,8 parece bom para DNA, mas pode escongar presença de fenóis residuais ou de proteínas com aroma sulfídrico. O A260/A230 é mais sensível a contaminantes orgânicos como guanidina ou etanol. Valores abaixo de 2,0 nesse parâmetro são sinal de aviso. Se você estiver fazendo clonagem ou sequenciamento, repasse a purificação com coluna de limpeza específica ou precipitação adicional. O A260/A280 sozinho não conta a história completa. A eletroforese em gel de agarose continua sendo a ferramenta mais honesta para avaliar integridade. DNA de alta qualidade mostra uma banda nítida, sem trail. RNA mostra três bandas distintas correspondendo aos ribossomos 28S, 18S e 5S, com a 28S aproximadamente o dobro de intensidade da 18S. Se você vê degradação, ou smear, o problema está na etapa de lise ou na presença de nucleases ativas. Ajustar o pH da solução de lise para o intervalo entre oito e nove evita ativação de DNases endógenas na maioria dos tecidos. Esse é um detalhe que poucos protocolos destacam, mas faz diferença.
Se o objetivo é RNA para transcriptômica, considere também o uso de DNase on-coluna durante a purificação. A contaminação por DNA genômico é comum e pode distorcer resultados de qPCR se não for removida. O tratamento com DNase I após a eluição funciona, mas exige um segundo passo de purificação para remover a enzima e os íons de magnésio. Fazer aDNase diretamente na coluna economiza tempo e reduce o risco de perda de amostra. Um erro frequente na etapa de eluição é usar água com pH neutro em vez de tampão aquecido. A água pura tem pH variável e pode não liberar todo o ácido nucleico da membrana de sílica gel. O ideal é usar TE 10 milimolar ou água com pH ligeiramente alcalino, entre 8,0 e 8,5, e pré-aquecer a cerca de sessenta graus. Isso aumenta o rendimento em até vinte por cento em comparação com água fria. Parece pouco, mas em amostras limitadas como biópsias pequenas ou células únicas, esses dezesseis microlitros a mais podem ser a diferença entre ter ou não material suficiente para a análise.
Por fim, a armazenagem. DNA em TE a menos vinte graus dura anos sem problemas. A menos setenta, ainda melhor. RNA deve ser mantido a menos setenta ou menos oitenta, preferencialmente em TE ou tampão similar, nunca em água pura. A hidrólise ácida ocorre lentamente mesmo em condições neutras e acelera com ciclos de temperatura. Se você precisa usar RNA frequentemente, mantenha a solução principal congelada e uma alíquota de trabalho descongelada na gelo, trocando-a a cada poucos dias. Ácidos nucleicos não são bichos de sete cabeças, mas exigem respeito pelas variáveis. Cada amostra tem um comportamento próprio. Protocolos genéricos funcionam para a maioria das situações, mas os problemas reais aparecem quando você sai da curva normal. Anotar ajustes, resultados e falhas num caderno de laboratório é mais útil do que qualquer dica rápida. Com o tempo, você desenvolve intuição sobre o que ajustar e, mais importante, sobre quando desistir de uma amostra e pegar outra.
