O que você precisa saber sobre as enzimas de restrição antes de começar
Muita gente entra num cloning e acha que basta escolher uma enzima e jogar no tubo. A realidade é bem mais chatinha. As enzimas de restrição podem ser chamadas de tesouras moleculares, mas esse termo é tão batido que quase não comunica nada útil. Elas são proteínas bacterianas que reconhecem sequências específicas de DNA e cortam em pontos predizíveis. O resto da história depende de você saber o que está fazendo.
As enzimas de restrição podem ser chamadas de nucleases de restrição
O nome técnico correto é nuclease de restrição ou endonuclease de restrição. Tipo I, Tipo II, Tipo III. Tipo II é a que importa na prática. É a única que corta dentro ou perto do sítio de reconhecimento, o que significa que você consegue prever o tamanho dos fragmentos. As outras duas precisam de ATP e cortam em locais aleatórios, então ninguém usa elas fora de contextos bem específicos de pesquisa acadêmica avançada. O sítio de corte varia. EcoRI reconhece GAATTC e faz um overhang de 4 nucleotídeos 5'. BamHI corta GGATCC. HindIII, AAGCTT. Cada uma tem suas próprias características de buffer, temperatura e eficiência que não são intercambiáveis sem teste prévio. Você já vai entender o porquê.
Doubling star activity é um problema real. Se você deixar uma enzima como EcoRI incubar por muitas horas ou usar concentração de glicerol acima de 5%, ela começa a cortar em sítios parecidos mas não idênticos. Já vi digestão dupla falhar porque o protocolo pedia 2 horas a 37°C e ninguém avisou que a Star Activity aparecia depois de 90 minutos. A solução não é confiar no folheto do fabricante. É testar o tempo mínimo necessário e manter a concentração de glicerol abaixo de 5% no volume final.
Como escolher e usar na prática
A escolha da enzima começa pelo desenho do primer ou pela sequência do vetor. Você mapeia os sítios de restrição existentes, evita os que estão dentro do gene de interesse e escolhe os que geram extremidades compatíveis. Extremidades coesivas são melhores para ligacao direta. Extremidades blunt funcionam mas com eficiência muito menor — tipo 10% da eficiência de coesivas, na média. Buffer é onde muita gente erra. Diferentes enzimas precisam de salinidades diferentes. NEB e Thermo Fisher fornecem tabelas de compatibilidade, mas elas nunca cobrem todos os cenários. Quando você faz uma digestão dupla com duas enzimas que têm requisitos diferentes, precisa encontrar um buffer que funcione para ambas ou fazer digests sequenciais. Sequencial é mais seguro na maioria das vezes, mas gasta mais tempo e aumenta o risco de desfosforilação indesejada ou contaminação cruzada entre etapas.
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Uma coisa que o manual não enfatiza suficiente: a relação enzima-substrato. A recomendação padrão é 1 unidade de enzima para 1 micrograma de DNA. Em situações reais, eu uso 5 a 10 unidades por micrograma quando o DNA é metilado ou quando o sítio está em contexto pouco favorável. DNA genomico puro frequentemente precisa de mais enzima do que DNA plasmidial preparado com kit. A metilação de host pode bloquear completamente o corte se você não verificar o strains de E. coli usado na preparação. Digeração incompleta é o erro mais comum em clonagem. Você vê bandas extras no gel, atribui a algo e tenta seguir adiante. O problema é que digestão incompleta gera fundos altíssimos de colonies não-recombinantes. A correção não é aumentar a temperatura — isso piora a star activity. É aumentar o tempo de incubação em 30 minutos, usar mais enzima, ou fazer uma segunda digestão com a mesma enzima após purificar o produto da primeira.
Um caso específico que me marcou
Estava fazendo uma clonagem com XhoI e SalI num vetor pCR8/GW/TOPO. A digestão dupla no buffer recomendado pela NEB não funcionou de jeito nenhum. O gel mostrava o plasmídeo inteiro intacto. Testeibuffer, aumentei a enzima para 20 unidades, insisti por 3 horas. Nada. O vetor simplesmente não abria. O problema era metilação. O plasmídeo tinha sido preparado em uma linhagem E. coli que expressava metilase de DNA que protegia o sítio de XhoI. Mudei para um plasmídeo preparado em DH5alpha
Limitações que ninguém Conta
Enzimas de restrição não resolvem problemas de frame. Se você colocar um fragmento num sítio de restrição e a leitura de leitura não estiver alinhada, sua proteína será traduzora incorretamente ou truncada. Sempre verifique a fase de leitura após a ligacao, antes de transformar. Também não funcionam bem em regiões repetitivas ou com alto conteúdo GC. Sítios de restrição em sequências com mais de 70% GC frequentemente têm corte inefficiente porque a enzima tem dificuldade em separar as fitas. Nesses casos, adicionar BSA ou usar enzimas adaptadas para alto GC ajuda, mas não é garantia. Às vezes a solução é mudar o desenho do cloning para usar outro par de sítios.
Composição de buffers com PEG aumenta a eficiência de ligacao mas pode inibir enzimas de restrição se não for diluído adequadamente antes da digestão. É um ciclo vicioso: você precisa purificar o DNA após a digestão antes de ligar, e cada etapa de purificação perde rendimento. Em protocolos de alto throughput onde o rendimento inicial é baixo, essas perdas acumuladas podem resultar em menos de 10% da quantidade esperada de produto final. O custo também é fator. Enzimas de restrição premium custam entre 150 e 400 reais por 20 unidades. Digestões duplas consomem duas enzimas. Se você trabalha com clones em série, o gasto mensal pode passar de mil reais sem aviso. Usar enzimas mais baratas de marcas menos consolidadas às vezes funciona, mas a variabilidade de lote é maior e você perde tempo validando cada novo frasco.
