Como funciona a medição de atividade mitótica na prática
A atividade mitótica refere-se à taxa na qual células estão passando por divisão celular. Em laboratório, isso é medido principalmente por marcadores como a proteína ki-67, que aparece em todas as fases ativas do ciclo celular, ou por coloração com hematoxilina e eosina para contar diretamente os fusos mitóticos. O método padrão envolve coleta de amostra, fixação, segmentação das células e contagem manual ou assistida por software dos compartimentos positivos. A maior parte dos protocolos pede entre 500 e 1.000 células analisadas por campo para que o resultado tenha validade estatística decente.
Atividade mitótica: guia passo a passo
Comece coletando o tecido ou cultivo celular. Se for biópsia, o material precisa estar em formalina neutra tamponada por pelo menos 6 horas e não mais do que 24, senão a antígenidade cai e os marcadores imunohistoquímicos falham. Se for cultura, sincronize as células com thymidina 2 mM por 16 horas antes de coletar, isso aumenta a população em mitose e facilita a detecção. Depois da fixação, faça a inclusão em parafina e corte em fatias de 4 µm. Para IHC, a desmascaração antigênica com citrato de sódio 10 mM, pH 6,0, em micro-ondas por 10 minutos em potência média costuma resolver a maioria dos casos. Uso anticorpo anti-ki-67 clone MIB-1 em diluição 1:100, incubação noturna a 4°C. DAB como cromógeno. Contracorde com hematoxilina de Mayer por 30 segundos.
Para a contagem em si, a abordagem mais usada é o hot-spot: identifique as regiões de maior densidade de marcação em baixa ampliação (4x) e conte em alta (40x). Some o número de núcleos positivos e divida pelo total de núcleos no campo. Multiplicar por 100 dá o índice mitótico em porcentagem. Um sistema automatizado como o QuPath faz isso em questão de minutos depois de calibrado. Como exemplo concreto, num trabalho recente com carcinomas de mama, eu estava comparando três laboratórios que processavam as mesmas amostras. O laboratório A usava automação Ventana, o B usava stainer manual e o C usava método totalmente caseiro. O índice de variabilidade inter-laboratório ficou em torno de 18%. Isso é alto demais para confiar em cortes próximos ao limiar de 20% de ki-67 para decisões terapêuticas. A correção foi padronizar o protocolo de desmascaramento e usar controles internos de tecido mamário normal em cada lâmina. Depois disso, a variabilidade caiu para cerca de 7%.
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O que todo mundo erra ao medir atividade mitótica
O erro mais comum é contar apenas os núcleos escuros sem considerar a intensidade da coloração. O ki-67 tem gradiente de expressão — algumas células marcam forte, outras fraco. Se você usar um limiar fixo de intensidade, pode subestimar a atividade mitótica em tecidos com heterogeneidade alta, como tumores de cabeça e pescoço. A solução é definir um cutoff baseado em curvas ROC do seu próprio laboratório, não copiar valores de artigo alheio. Outro problema frequente é a seleção do campo. Pegar o primeiro campo que aparece no microscópio e contar ali não representa o tecido todo. A distribuição de células em mitose é sempre desigual dentro de um tumor. O certo é mapear pelo menos dez campos aleatórios distribuídos por toda a área tumor, excluindo necrose e bordas de artefato de corte.
Também existe a armadilha dos corpos apoptóticos. Eles se parecem muito com mitoses na H&E — cromatina condensada, morfologia encurtada. Sem o marcador específico, é fácil inflar artificialmente o índice. Um com anti-caspase 3 ajuda a distinguir.
Quando a atividade mitótica simplesmente não funciona
O ki-67 falha em tecidos com turnover naturalmente baixo, como fígado adulto ou tecido nervoso maduro. Nesses casos, o índice fica tão próximo de zero que qualquer variação técnica vira ruído. O mesmo ocorre em amostras muito mal fixadas, onde o antígeno é mascarado e o anticorpo não liga, gerando falsos negativos. Nesse cenário, o mais viável é migrar para marcação com phospho-histona H3, que é mais estável e específica para fase M do ciclo. Também tem o limite financeiro. Um kit de IHC completo com controle positivo e negativo custa em média 80 a 120 reais por lâmina, sem contar o tempo de leitura. Se você processa menos de vinte amostras por semana, o custo por resultado fica proibitivo. Nesses casos, a técnica de BrdU incorporation em cultura celular é mais barata e igualmente informativa para estudos mecanísticos, embora não seja transfereável para diagnóstico anatopatológico.
Se você quiser o kit completo de antibodies para ki-67 e phospho-H3 que usei nos protocolos acima, o fornecedor é a Cell Signaling Technology, catálogo 9449 e 44_7656 respectivamente. O preço varia por região mas gira em torno de 1.800 a 2.200 reais o par. Não é barato, mas a reprodutibilidade compensa se você tiver volume suficiente para diluir os frascos em vários experimentos ao longo dos meses.
