Composicao Quimica Da Celula

A composição real das células no laboratório

A composicao quimica da celula nao é um conceito abstrato. Quando voce entra no laboratorio e precisa quantificar o que ha dentro de uma celula, a situacao e bem mais baguncada do que os livros mostram. A maior parte do que voce vai encontrar e agua, claro, mas a porcentagem varia muito dependendo do tipo celular. Um adipocito tem menos de 10% de agua. Um hepatocito gira em torno de 70%. Isso altera completamente como voce prepara a amostra para analisis.

composicao quimica da celula: o que realmente existe la dentro

Depois da agua, as proteinas dominam tudo. Elas representam cerca de 55% da massa seca de uma celula animal media. Lipideos ficam em torno de 15%, carboidratos 5%, acidos nucleicos 5-10% e os ions e pequenas moleculas completam o restante. Mas aqui esta o detalhe que quase todo mundo pega errado na hora pratica: a distribuicao nao e uniforme. O citoplasma, o nucleo, as mitocondrias... cada compartimento tem uma composicao quimica radicalmente diferente. A membrana plasmatica, por exemplo, e basicamente um tandem de lipideos e proteinas em proporcao quase igual, cerca de 50-50 em massa. Ja o citoplasma gelificado, o citosol propriamente dito, e predominantemente agua com proteinas dissolvidas. Se voce fizer uma fracaoamento cellulare e coletar apenas o sobrenadante apos centrifugacao, voce esta basicamente analisando o citosol, nao a celula inteira. Isso causa confusao constante em relatorios de pesquisa.

Dentro da classe das proteinas, ha uma hierarquia de abundancia que reflete necessidades metabolicas. Enzimas metabolicas como a gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase sao extremamente abundantes. Proteinas estruturais como a actina e a tubulina also estao em concentrations elevadas. Mas proteinas sinalizadoras como receptores de membrana podem ser raras, algumas vezes menos de 1000 copias por celula. Isso importa quando voce esta planejando um experimento de western blot ou espectrometria de massas.

Metodo de analise na pratica

Voce precisa isolar as macromoleculas primeiro. O metodo classico envolve lisar as celulas com um detergente nao ionico como Triton X-100 ou NP-40, mantendo as amostras geladas para evitar degradacao enzimatica. Depois, centrifugar para remover debris e organelas intactas. O sobrenadante contem proteinas solaveis e lipideos. Para acidos nucleicos, voce precisa de um passo adicional de precipitacao com etanol ou isopropanol. A quantificacao de proteinas normalmente usa o metodo de Bradford ou BCA. Bradford e mais rapido, leva uns 30 minutos, mas sofre interferencia de detergentes. BCA aguenta melhor detergentes como SDS ate concentrations de 5%, mas leva cerca de 2 horas. Para lipidios, a extracao com cloroformio-metanol no protocolo de Folch ainda e o padrao ouro, embora exija trabalho com solventes organicos e boa ventilacao. Carboidratos podem ser medidos pelo metodo de phenol-acido sulfurico, que e geral mas nao especifico para um tipo de acai.

Uma coisa que aprendi na marra: nunca confie em um unico metodo de quantificacao para composicao quimica da celula. Voce vai ter discrepancias. No meu caso, ao analisar tecido hepatico de ratos tratados com uma substancia hepatotoxica, o metodo de Bradford via 2.5 mg de proteinas por mg de tecido. O BCA via 3.8 mg. A diferenca parecia insolita ate eu perceber que a toxina havia acumulado grandes quantidades de lipideos neutros nas celulas, que interferiam na absorbancia do Bradford mas nao do BCA. O valor real provavelmente estava mais perto de 3.2 mg, considerando tambem a dosagem por bicinconina em triplicata com curva padrao feita no mesmo homogenato para corrigir efeitos de matriz.

Detalhes tecnicos que fazem diferenca

A composicao de ions intracelulares e kritica e muitas vezes subestimada. Potassio e o cation principal dentro da celula, tipicamente 140 mM, enquanto sodio fica em torno de 10-15 mM. O calcio citosolico livre e absurdamente baixo, cerca de 100 nanomolar, mas isso permite que ele funcione como um sinalizador robusto. Quando voce lisifica as celulas para analisis, esse equilibrio se desfaz completamente. O calcium entra no citosol e voce perde a informacao sobre o gradiente fisiologico. Se voce precisa preservar essa informacao, tem que usar tecnicas de imageamento por fluorescencia com indicadores como Fura-2 ou Aequorina, nao analisis bioquimicas convencionais. A mesma logica se aplica a nucleotideos. O ATP intracelular pode ser de 1 a 10 mM dependendo do tecido e do estado metabolicos, mas na hora da lisacao, a ATPase libera de phosphato quebra o ATP rapidamente se voce nao inibir as enzimas com acidificacao ou inibidores especificos.

Outro ponto importante: a composicao quimica da celula varia com o ciclo celular. Células em fase S tem maior conteudo de DNA e ribossomos ativos para sintese proteica. Células em G0, quiescentes, tem perfil metabolico totalmente diferente. Se voce esta trabalhando com cultura celular e mescla fases do ciclo, os dados de composicao quimica ficam diluidos e menos informativos. Sincronizar a cultura ou separar por FACS antes da analise faz sentido quando voce precisa de precisao.

Problemas comuns e como resolver

Um erro frequente e assumir que a composicao quimica da celula e constante entre diferentes tecidos. Ela nao e. Neurônios tem muito mais lipideos devido as bainhas de mielina. Osteoblastos depositam matriz mineralizada rica em calcio e fosfato. Celulas musculares esqueléticas sao repletas de proteinas contrateis como miosina e actina. Se voce pega um protocolo generico e aplica em qualquer tecido, os resultados vao estar errados em pelo menos um fator de dois para alguns componentes. A contaminacao por matriz extracelular tambem distorce resultados, especialmente em tecidos solidos. Colageno, fibronectina, elastina podem representar uma fracao significativa do tecido. Se voce nao remover ou quantificar essa contaminacao, vai superestimar a composicao intracelular. inclui digestao colagenase para isolar celulas viáveis antes da analise, ou entao fazer uma marcacao histologica para estimar a fração de matriz no tecido.

Para acidos nucleicos, a contaminacao por RNA quando voce quer DNA, ou vice-versa, e comum. A ribonuclease e onipresente e extremamente stabile. Usar guani-dinio isotiocianato no metodo de isolamento de RNA, como no TRIzol, ajuda a desnaturar RNases rapidamente. Para DNA genomico, proteinase K e incubacao a 56°C por varias horas sao standard, mas lembre-se que DNA alto peso molecular pode ficar viscoso e difícil de manipular se nao for manuseado com cuidado, evitando vortex forte.

Limitações que voce precisa saber

Nenhum metodo analitico convencional consegue dar uma composicao quimica completa e absoluta de uma celula unica. Tecnicas como citometria de massa de imagem (MIBI-TOF) e espectrometria de massas de ionizacao por electrospray em celulas individuais estao avancando nisso, mas sao caras, complexas e ainda com limitações de throughput. Para a maioria dos laboratorios, a composicao quimica da celula continua sendo determinada por medio de populacoes de celulas, o que perde heterogeneidade individual. Além disso, metodos bioquímicos clássicos frequentemente destroem a estrutura celular. Você obtém dados de composição, mas perde informação sobre compartimentalização. Para entender funções, você precisa integrar com técnicas de imageamento e fracionamento. Uma abordagem combinatória, mesmo que simples, como fracionamento diferencial seguido de análise bioquímica das fracções, geralmente entrega resultados mais confiáveis do que apenas homogenização total.

O custo também é um fator pratico. Analisar lipideos por cromatografia em camada delgada ou HPLC requiere equipamento e padsão. Espectrometria de massas para proteomica e lipidomica pode custar centenas de dolares por amostra se terceirizado. Para composicao quimica da celula com fins didáticos ou rotineiros, metodos espectrofotometricos convencionais ainda fazem sentido e oferecem boa precisao quando bem executados, apesar de menos abrangentes. O que funciona na pratica e definir claramente o que voce quer saber antes de escolher o metodo. Se o foco e proteinas, va de Bradford ou BCA com controles adequados. Se quer lipidios, Folch com pesagem precisa dos solventes. Para carboidratos, phenol-acido sulfúrico com padrao de glicose. Nao tente fazer tudo de uma vez com um unico protocolo genérico. Cada classe molecular tem suas armadilhas e exige condicoes especificas de manipulacao para dados confiaveis.