Fita Complementar Do Dna

O que é e quando você realmente precisa fazer

A fita complementar do DNA — o que a gente chama de cDNA — é aquela sequência gerada a partir de um molde de RNA mensageiro pela transcriptase reversa. Não é uma técnica mágica. É o passo padrão quando você precisa amplificar, clonar ou quantificar genes sem a interferência de introns, que o RNA genomico traz junto. Se o seu objetivo é expressão gênica em bactéria, por exemplo, não adianta nada usar DNA genômico. As bactérias não removem introns. O cDNA é obrigatório nesse caso. No laboratório, o processo começa com a extração de RNA total ou poli-A selecionado. A parte que mais dá problema aqui é a integridade do RNA. Se o seu RNA estiver degradado, o cDNA vai vir truncado e a reação de PCR posterior não responde como esperado. Eu já perdi três dias tentando clonar um gene que simplesmente não aparecia no gel, até perceber que a amostra de RNA tinha passado por dois ciclos de descongelamento sem gelo seco suficiente. O RNA degrada rápido. Trabalhe sempre com RNase-free de verdade, não só com a garrafa que está na bancada faz seis meses.

Fita complementar do dna: montagem prática da reação

Para uma reação padrão de síntese de cDNA de primeira cadeia, você precisa montar isso aqui: - 1 microgram a 5 microgramas de RNA total (quantidade ideal depende do tamanho do transcrito que você quer capturar; transcritos longos exigem mais RNA de partida)

- 0,5 microgramas de oligo(dT) ou de um primer específico para o transcrito de interesse - dNTPs a 1 miliMolar cada

- Buffer de reação conforme o fabricante (geralmente Tris-HCl pH 8,3, KCl 50 milimolar, MgCl 6 milimolar, DTT 10 milimolar) - Transcriptase reversa: M-MLV ou SuperScript III. A SuperScript tem maior tolerância térmica, o que ajuda com estruturas secundárias no RNA

- Nuclease livre em água DEPC ou water molecular grade RNase-free A sequência térmica típica é: 25°C por 10 minutos para o annealing do primer, 42°C a 50°C por 50 minutos para a extensão, e 70°C por 15 minutos para inativação da enzima. Depois disso, você pode adicionar RNase H para digerir o RNA remanescente antes de ir para a PCR.

O detalhe que os protocolos não mostram com clareza: a temperatura de extensão importa mais do que você imagina. Se o seu transcrito tem muita estrutura secundária — que é o caso de muitos transcripts de eucariotos com high GC content — rodar a 42°C pode gerar paradas prematuras da polimerase. Subir para 50°C ou até 55°C com a SuperScript III resolve boa parte desse problema. Eu cheguei a perder duas clonagens inteiras porque usei M-MLV padrão a 37°C num transcrito com 68% de GC. A enzima para no meio do caminho, gera cDNA truncado, e você não percebe até montar o clone e sequenciar.

Pontos onde a coisa costuma dar errado

Tem três problemas recorrentes que eu vejo todo dia no laboratório. O primeiro é contaminação por DNA genômico. Mesmo usando DNase treatment, restos de DNA genômico podem permanecer na preparación de RNA. Se a sua PCR não tiver primers que cruzem um splice junction, você vai amplificar tanto cDNA quanto DNA genômico residual. A solução é incluir um controle negativo sem transcriptase reversa — o chamado minus RT control — em todas as reações. Se a banda aparecer nessa amostra, seu problema é contaminação genômica, não falha de síntese de cDNA. O segundo problema é a eficiência de conversão. A eficiência de síntese de cDNA raramente ultrapassa 70 a 80% com protocolos convencionais. Transcritos raros podem ter representação muito abaixo do esperado simplesmente porque o primer de oligo(dT) não alcança todos os moléculas de RNA de forma uniforme. Se você está trabalhando com expressão diferencial de genes pouco abundantes, considere usar primers aleatórios (random hexamers) em vez de oligo(dT), ou fazer uma combinação dos dois. Random hexamers cobrem melhor a diversidade de transcrtos, mas geram cDNA de menor tamanho médio.

O terceiro problema, mais sutil, é a formação de artefatos de complementaridade. Quando você tem regiões repetitivas no transcrito, a transcriptase reversa pode causar switch de fita — o chamado template switching. Isso pode gerar produtos de PCR com inserções ou deleções não esperadas. O artefato é particularmente problemático em RNA-seq, onde essas junções mal mapeadas geram leituras descartáveis. Protocolos mais recentes como o SMART-seq usam um adiciona um resíduo de citosina na extremidade 3' do cDNA para capturar o produto de forma mais controlada, reduzindo esse tipo de artefato em cerca de 40% comparado ao protocolo padrão.

Quantificação e uso direto

Depois de sintetizar o cDNA, a quantificação por spectrophotometry sozinha não é confiável. O Nanodrop vai te dar uma concentração, mas não diferencia cDNA de RNA não convertido, de primers remanescentes ou de saliós. A melhor abordagem é usar qPCR com primers específicos para um gene de referência conhecido, como GAPDH ou ACTB, e comparar com uma curva padrão de cDNA conhecido. Isso te dá uma noção real da eficiência de conversão e da quantidade de cDNA funcional disponível. Para clonagem, o cDNA sintetizado pode ser diretamente adaptado com adaptadores por ligação de caudas homopolímeras ou por Gibson assembly, dependendo do vetor. A eficiência de transformação em E. coli competente varia de 10 a 10 cfu por micrograma de DNA, mas o cDNA de cadeia simples tem eficiência de transformação muito menor que DNA de cadeia dupla. Se você precisa de alta complexidade de biblioteca, considere fazer a segunda cadeia de DNA usando DNA polimerase I e ligase, convertendo o cDNA de cadeia simples em dupla fita antes da clonagem.

Se o seu fluxo de trabalho envolver sequnciamento de nova geração, a qualidade do cDNA determina diretamente a cobertura do transcriptoma. Reações mal feitas geram viés de cobertura extremo, com regiões 5' sub-representadas porque a transcriptase reversa não consegue percorrer o transcripto inteiro. Para contornar isso,fragmentar o cDNA depois da segunda cadeia, em vez de fragmentar o RNA original. Fragmentação enzimática com RNase III seguida de síntese de segunda cadeia produz libraries com distribuição de comprimento mais uniforme.