O que você precisa saber antes de começar a manipular DNA e RNA
A molécula de dna e rna são os dois tipos de ácido nucleico que existem nas células, mas tratar os dois da mesma forma é o erro mais comum. A diferença prática mais importante é que o DNA é estável e sobrevive bem em condições normais de trabalho, enquanto o RNA se degrada com facilidade extrema. Se você não levar isso em conta no início, todo o resto do protocolo vai para o lixo. Eu já perdi amostras inteiras porque usei a mesma sequência de centrifugação para isolamento de DNA e RNA. O rotor estava correto, os reagentes também, mas o RNA ficou completamente degradado e não consegui nada na eletroforese. A solução foi separar as bancadas, usar ponteiros descartáveis esterilizados e tratar tudo como se estivesse lidando com material vivo que simplesmente desaparece se você piscar.
molecula de dna e rna: diferenças práticas que fazem sentido
O DNA carrega a informação genética de forma permanente. É duplo, tem desoxirribose e a base timina no lugar de uracila. O RNA é basicamente uma versão temporária e geralmente simples de funcionar como mensageiro entre o DNA e a produção de proteínas. Essas diferenças estruturais explicam por que o RNA precisa de cuidados diferentes durante extração, armazenamento e manipulação. Aqui vai algo que muitos manuais não explicam direito: a presença de RNases no ambiente é o verdadeiro problema, não a atividade das DNases. RNases são enzimas que degradam RNA e elas estão em tudo. Pele, poeira, superfícies, água comum. Elas sobrevivem a altas temperaturas e não são facilmente destruídas por autoclavação padrão. Isso significa que uma bancada limpa visualmente pode estar repleta de RNases ativas.
Como extrair RNA de boa qualidade — um protocolo real
Use o método de extração com fenol-clorofórmio ou colunas de sílica, dependendo da sua amostra. Para cultura celular, colunas funcionam bem e levam cerca de 30 minutos. Para tecido, o método com fenol é mais eficiente mas exige mais tempo e cuidado com materiais perigosos. Aqui está o passo a passo que eu uso atualmente:
Lise o tecido ou células em Trizol ou reagente similar. Homogeneíze bem se for tecido, porque fragmentos não lisados perdem material. Adicione clorofórmio, misture vigorosamente e centrifogue a 12.000 g por 15 minutos a 4 graus Celsius. A fase aquosa superior contém o RNA. Transfira com cuidado para um tubo limpo, sem tocar na fase intermediária nem na orgânica. Precipite o RNA com álcool isopropílico. Deixe em temperatura ambiente por 10 minutos se estiver usando coluna, ou a -20 graus por 30 minutos se for precipitação clássica. Centrifuge, lave com etanol 75 por cento preparado com água livre de RNase e deixe secar levemente. Não seque completamente, senão o RNA não ressuspende.
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Ressuspenda em água livre de RNase ou tampão TE. Meça a concentração e pureza no espectrofotômetro. Os valores de Abs260/280 ideais ficam entre 1,9 e 2,1. Abaixo disso indica contaminação com proteína ou fenol. O quociente Abs260/230 deve ser maior que 2,0 para indicar baixa contaminação com sais e compostos orgânicos.
Problemas comuns e como resolver
O RNA degradado aparece na eletroforese como um borrão em vez de duas bandas nítidas de subunidades ribossômicas. Se isso acontecer, o problema quase sempre está nas RNases ou em ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Uma vez que o RNA é congelado, descongele apenas a quantidade que vai usar e descarte o resto. Voltar a congelar destrói a integridade da molécula. Outro problema frequente é baixa rendimento na extração de tecido fibroso. Músculo, fígado e tecidos conectivos exigem homogeneização mais agressiva. Eu uso lisador mecânico com esferas de vidro por dois minutos em vez de homogeneizar manualmente. O rendimento aumenta significativamente e o tempo de processo cai de 45 minutos para cerca de 20 minutos no total.
Se você precisa fazer RT-qPCR, certifique-se de remover DNA genômico residual. Um tratamento com DNase I durante a purificação resolve. Inclua um controle sem transcriptase reversa para verificar se há contaminação por DNA no final. Sem esse controle, resultados de quantificação gênica podem ser falsamente positivos.
O que a molécula de dna e rna não são e onde as pessoas erram
DNA não é sinônimo de informação genética funcional. Apenas uma fração pequena do genoma codifica proteínas. Grande parte é regulatória, estrutural ou não codificante. O RNA, por sua vez, não é apenas mensageiro. Existem RNAs ribossomais, de transferência, microRNAs, lncRNAs e muitos outros tipos com funções regulatórias importantes. Tratar todos como igualmente passíveis de análise pelo mesmo método gera dados confusos e interpretações equivocadas. A limitação mais séria que encontro na prática é a variação entre lotes de kits de extração. Dois lotes diferentes do mesmo fabricante podem dar rendimentos diferentes para a mesma amostra. Isso não aparece nos manuais. Teste cada lote novo com uma amostra de controle antes de processar suas amostras reais. Perde uma tarde, mas evita semanas de resultados inconsistentes.
O DNA pode ser armazenado a -20 graus por anos sem degradação significativa se estiver em solução adequada. O RNA precisa de -80 graus para armazenamento de longo prazo. A -20 graus ele degrada perceptivelmente em questão de meses. Se seu laboratório só tem freezers convencionais, considere converter o RNA em cDNA e armazenar a cDNA, que é muito mais estável.
