O que você precisa saber sobre a técnica antes de começar
A southern analysis, ouSouthern blot, é um método de detecção de sequências específicas de DNA através de hibridização com uma sonda marcada. O básico funciona assim: você extrai DNA genômico, corta com enzimas de restrição, separa os fragmentos por tamanho em gel de agarose, transfere para uma membrana de nylon ou nitrocelulose e hibridiza com uma sonda complementar marcada. O resultado é uma banda que revela o tamanho e a presença do fragmento de interesse. Nada de mágica, só bioquímica aplicada com paciência. Eu já fiz dezenas de southern blot ao longo dos anos, e a maioria das pessoas subestima a complexidade do procedimento quando lê o protocolo pela primeira vez. O problema não está na teoria, está nos detalhes que ninguém conta até você falhar e ter que refazer três vezes.
Por que você ainda deve dominar a southern analysis
Apesar da ascensão de técnicas como qPCR e sequenciamento de nova geração, a southern analysis continua sendo insubstituível em cenários específicos. A principal vantagem é a capacidade de fornecer informações estruturais sobre o genoma que outras técnicas não conseguem. Você consegue determinar o tamanho exato do fragmento contendo o gene de interesse, identificar rearranjos cromossômicos, detectar integrações múltiplas de transgenes e verificar a cópia única versus múltipla em linhagens transgênicas. O que a maioria dos iniciantes não compreende é que a southern analysis exige um planejamento rigoroso antes mesmo de você tocar no gel. A escolha da enzima de restrição é crítica e errar isso consome mais tempo do que qualquer outro passo do protocolo. Se você escolher uma enzima que corta dentro da região reconhecida pela sonda, vai gerar fragmentos menores que não serão detectáveis. Sempre mapeie o sítio de restrição antes de prosseguir.
No meu caso, tive um problema específico com um clone de BAC que precisava ser verificado quanto à integridade do inserto. A sonda foi desenhada para cobrir uma região central do inserto, e a enzima escolhida era EcoRI. O gel mostrou bandas estranhas além da esperada, algo que não correspondia ao mapa teórico. O problema era que o DNA estava parcialmente degradado durante a extração, e os fragmentos menores gerados por corte incompleto estavam migrando de forma anomala no gel. A solução foi repetir a digestão com enzima fresca, aumentar o tempo de incubação para 3 horas a 37°C, e usar uma concentração menor de DNA no gel para melhorar a resolução. Isso economizou pelo menos dois dias de trabalho desperdiçado.
Montando o experimental
A quantificação do DNA é o primeiro passo prático e o mais negligenciado. Você precisa de cerca de 5 a 10 microgramas de DNA genômico por poço para obter bandas nítidas. Menos que isso resulta em sinais fracos ou ausentes. Mais que isso causa sobrecarga no gel e difusão das bandas. Use espectrofotometria para quantificar e verifique a pureza pelo rácio 260/280, que deve ficar entre 1,8 e 2,0. Se estiver abaixo disso, há contaminação com proteína ou fenóis que interferem na digestão enzimática. A digestão com enzimas de restrição deve ser feita em volume suficiente para garantir consumo completo do DNA. Um erro comum é usar volume mínimo e confiar no tempo recomendado pelo fabricante. Enzimas perdem atividade com o tempo, especialmente após múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento. Sempre use enzima fresca e adicione BSA se o buffer fornecido não contiver. A digestãoovernight a 37°C é padrão, mas algumas enzimas trabalham melhor em temperaturas diferentes. Consulte o catálogo do fabricante para cada enzima específica.
O gel de agarose precisa ter concentração adequada ao tamanho dos fragmentos que você espera detectar. Para fragmentos entre 1 e 20 kb, use gel a 0,8%. Fragmentos maiores exigem gel a 0,5% a 0,6%. Concentrações mais altas resolvem melhor fragmentos pequenos, mas dificultam a transferência para a membrana porque os poros ficam muito estreitos. A transferência por capilaridade é o método mais comum. Você monta um sándwich com papel filtro, a gel, a membrana e pilhas de papel absorvente, tudo imerso em solução de transferência. A solução padrão contém 0,4 M de NaOH e 1,5 M de NaCl para DNA genômico, ou 0,5 M de NaOH e 1,5 M de NaCl para transferir também RNA se necessário. O processo leva de 12 a 18 horas dependendo da espessura do gel e do tamanho dos fragmentos. Fragmentos maiores que 10 kb exigem mais tempo, às vezes até 24 horas.
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Após a transferência, o DNA precisa ser fixado na membrana. Para membranas de nylon, o cruzamento ultravioleta é o método preferido, com exposição de 120 milijoules por centímetro quadrado. Membranas de nitrocelulose exigem secagem em forno a 80°C por 2 horas. O cruzamento UV em excesso pode fragmentar o DNA e reduzir a eficiência de hibridização, então calibrar o equipamento é importante.
Hibridização e detecção
A preparação da sonda determina diretamente a qualidade do resultado. Sondas marcadas com digoxigenina ou biotina permitem detecção não radioativa, o que é mais seguro e prático para laboratórios que não possuem licença para material radioativo. A marcação por random priming é o método mais utilizado, produzindo sondas com atividade específica de 10^8 a 10^9 dpm por microgramas quando usa 32P, ou sinal equivalente quando usa sistemas não radioativos. A pré-hibridização e a hibridização propriamente dita ocorrem em soluções comerciais ou caseiras. A solução rápida inclui 6x SSC, 5x Denhardt, 0,5% de SDS e DNA carrier calf thymus a 100 microgramas por mililitro. A hibridização ocorre a 42°C para sondas de DNA, ou 65°C se usar formamida na solução. O tempo varia de 6 a 16 horas, dependendo da complexidade do background e da especificidade desejada.
As lavagens pós-hibridização são onde muitos problemas surgem. Lavagens muito rigorosas removem sonda parcialmente coincidente e reduzem o sinal. Lavagens muito brandas aumentam o background. O protocolo padrão começa com duas lavagens de 15 minutos em 2x SSC com 0,1% de SDS, seguido de duas lavagens de 20 minutos em 0,1x SSC com 0,1% de SDS a 65°C. Ajuste astringência conforme necessário. Se o background estiver alto, aumente a temperatura de lavagem em 5°C ou reduza a concentração de sal em 0,1x. No sistema de detecção não radioativo com anticorpo anti-digoxigenina acoplado a fosfatase alcalina, o substrato quimioluminescente é adicionado e a membrana é exposta a filme de raio X por tempos que variam de 1 minuto a várias horas. O tempo de exposição depende da atividade específica da sonda e da sensibilidade do filme. Filmes de alta resolução como o X-Omat de Kodak oferecem melhor relação sinal-ruído do que filmes padrão.
Problemas comuns e como resolver
Fondas na membrana indicam que a digestão enzimática foi incompleta ou que o DNA estava degradado. Verifique a atividade da enzima e a qualidade do DNA antes de prosseguir. Linhas verticais no filme geralmente resultam de bolhas de ar presas entre o gel e a membrana durante a transferência. Remova bolhas com um rolo de pipeta Pasteur durante a montagem do sándwich. Background alto pode ser causado por saturação de sítios inespecíficos na membrana. Aumentar a concentração de DNA carrier ou prolongar o tempo de pré-hibridização resolve na maioria dos casos. Sinais fracos ou ausentes podem resultar de transferência incompleta, hibridização insuficiente ou sonda com baixa atividade específica. Refaça a transferência e verifique a eficiência marcando uma amostra de controle conhecida.
Um aspecto que poucos mencionam é a reutilização de membranas. Membranas de nylon podem ser stripping de sonda e reutilizadas várias vezes. O stripping é feito com solução de 0,1% de SDS a 95°C por 15 minutos, seguido de lavagem em água e secagem. Uma membrana bem tratada pode ser reutilizada até cinco vezes sem perda significativa de sensibilidade. Isso economiza tempo e reagentes, especialmente quando você precisa testar múltiplas sondas contra o mesmo blot. A southern analysis tem limitações sérias que precisam ser consideradas antes de escolher essa técnica. O procedimento leva de três a cinco dias para ser concluído. A quantidade de DNA necessária é maior do que em PCR. A sensibilidade é inferior à do PCR, exigindo pelo menos 10 a 100 cópias do alvo por genoma para detecção confiável. Técnicas como PCR digital e sequenciamento de longa leitura oferecem resolução muito superior para muitas aplicações e estão substituindo a southern analysis em contextos clínicos e de pesquisa rotineira.
A principal desvantagem prática é o tempo. Enquanto um southern blot leva cerca de quatro dias, uma análise de PCR com restrição ou sequenciamento Sanger leva apenas algumas horas e fornece informação similar ou superior na maioria dos casos. A southern analysis ainda é a escolha certa quando você precisa mapear estruturas genômicas complexas, estudar rearranjos cromossômicos em larga escala, ou validar integrações de transgenes em linhagens animais e vegetais onde a organização do inserto precisa ser determinada com precisão. Para referência de protocolos detalhados e reagentes, o site do fabricante da memória ou plataformas como o Addgene e oNCBI oferecem procedimentos revisados por pares com variações para diferentes tipos de amostra. A chave é adaptar o protocolo ao seu sistema biológico específico e documentar cada variação para poder reproduzir resultados futuros.
