Como funciona aSouthern hybridisation na prática
A Southern hybridisation é uma técnica de detecção de sequências específicas de DNA usando uma sonda marcada e memória de transferência para uma membrana. O nome vem de Edwin Southern, não de "sul" como alguns estudantes confundem no início. A técnica em si é bastante direta, mas tem várias armadilhas que só aparecem depois que você estraga o primeiro gel. O protocolo básico envolve três etapas principais: digestão com enzimas de restrição, separação em gel de agarose e transferência por capilaridade para uma membrana de nylon ou nitrocelulose. Depois disso, a hibridização propriamente dita com a sonda marcada e as lavagens de stringência para remover ligações inespecíficas.
Southern hybridisation: protocolo passo a passo
Prepare o gel de agarose entre 0,8% e 1% para fragmentos genômicos grandes. Concentração mais alta não ajuda — na verdade, piora a resolução de bandas acima de 10 kb. Use TAE em vez de TBE se for fazer transferência por capilaridade, porque o fosfato do TBE interfere na ligação da DNA à membrana de nylon carregada positivamente. Isso é algo que muitos manuais não mencionam com clareza. Digestão enzimática: use entre 5 e 10 µg de DNA genômico humano por corrida. Menos que isso e o sinal fica fraco demais para detectar cópias únicas. Mais que isso e o gel fica sobrecarregado, as bandas começam a chorar e a resolução cai. Enzimas de restrição com sítios raros, como NotI ou SfiI, são melhores para mapeamento de loci inteiros. Enzimas frequentes como EcoRI funcionam bem para detectores padrão.
Transferência por capilaridade leva entre 12 e 16 horas para fragmentos pequenos (até 5 kb) e até 48 horas para fragmentos maiores que 20 kb. Não tente acelerar isso com transferência eletrotransferência se estiver usando nylon — sim, funciona, mas a eficiência cai drasticamente e você gasta mais tempo otimisando do que ganhando. Membrana de nylon carregada positivamente retém até 10 vezes mais DNA que nitrocelulose, então certa já é suficiente para a maioria dos experimentos. Pré-hibridização: use soluciones como Hybridisation Buffer (da Roche) ou o protocolo caseiro com 6x SSC, 5x Denhardt, 0,5% SDS e DNA de espermatozoides de salmão desnaturado. Bloqueio de 1 hora a 37°C com agitação suave é suficiente. Depois disso, adicione a sonda marcada e incubação por 16 horas a 42°C para sondas de DNA de fita dupla ou 65°C se for oligonucleotídeo.
Lavagens de stringência: aqui é onde a maioria dos problemas aparece. Dois lavagens com 2x SSC/0,1% SDS por 15 minutos em temperatura ambiente, seguidas de duas lavagens com 0,1x SSC/0,1% SDS a 65°C por 20 minutos cada. Se o fundo ficar alto, aumente a temperatura da última lavagem para 70°C. Se o sinal sumir, diminua para 60°C. Astringência ideal depende do tamanho da sonda e do grau de complementaridade.
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Problema real que encontrei e como resolvi
Eu estava rastreando uma deleção genômica em uma linhagem celular e o sinal esperado simplesmente não aparecia. O gel parecia correto, a transferência funcionou (confirmei com staining com metileno azul), e a sonda estava marcada corretamente com P32. O problema era que o DNA genômico daquela linhagem tinha um polimorfismo no sítio de restrição dentro da região de hibridização. A enzima não cortava, o fragmento ficou enorme demais e migrou fora do gel. A solução foi refazer a digestão com uma enzima alternativa cujo sítio estivesse fora da região de interesse, validada antes por análise in silico com o sequence do locus. Isso me custou três dias extras e dois géis desperdiçados. Desde então, sempre faço um mapeamentovirtual das enzimas antes de escolher a digestão.
O que ninguém conta sobre Southern hybridisation
Primeiro: a sensibilidade da Southern não é o que os manuais sugerem. Detecção de cópias únicas em DNA genômico humano requer entre 0,1 e 1 ng de sonda marcada com atividade específica alta (acima de 10^8 cpmin/µg). Sondas menos ativas simplesmente não entregam sinal limpo, e você acaba aumentando o tempo de exposição no filme sem resolver nada. Segundo: a quimiluminescência substituiu o P32 na maioria dos laboratórios, mas ela tem um problema sério de linearidade dinâmica. A detecção por fósforo imagem é mais quantitativa, mas ainda assim a faixa linear fica entre 10 pg e 100 ng de DNA alvo. Fora disso, a intensidade da banda não reflete mais a quantidade real.
Terceiro: cross-hybridisation é mais comum do que se imagina. Sequências repetitivas como Alu em humanos vão ligar em múltiplos locais no gel. Se sua sonda tem homologia com regiões repetitivas, você vai ver um padrão de manchas em vez de bandas nítidas. Solução: usar sonda de cDNA em vez de genomic, ou pré-hibridizar com DNA de bloquese repetitivos (cot-1 DNA).
Limitações e quando não usar
Southern hybridisation é lenta. Um experimento completo leva entre 3 e 5 dias, sem contar a preparação da sonda e a otimização de condições. Para detecção qualitativa simples de presença ou ausência de um gene, PCR com primers específicos é muito mais rápido e barato. A Southern ainda é relevante quando você precisa determinar o tamanho exato do fragmento, detectar reorganizações genômicas grandes, ou quantificar cópias em ensaios de integração transgênica. Para copy number variation, qPCR ou digital PCR são alternativas superiores em velocidade e precisão. A Southern só se justifica quando a informação de tamanho do fragmento é criticas, como em estudos de rearranjo imunológico ou deleções grandes em terapia gênica.
Se você for fazerSouthern hybridisation pela primeira vez, comece com um controle positivo conhecido — DNA de linfoma com rearranjo de cadeia pesada da Ig, por exemplo. Isso valida todo o protocolo antes de você investir tempo em amostras desconhecidas. Erros de protocolos raramente são dramáticos; geralmente são pequenos desvios de temperatura, tempo de lavagem ou concentração de SDS que comprometem o sinal silenciosamente.
