Um Cientista Cultiva Uma Colonia De Bacterias

Como montar um experimento básico de cultivo bacteriano

Se você está começando com microbiologia no laboratório, o processo de um cientista cultiva uma colonia de bacterias é mais simples do que parece, mas existem detalhes que fazem diferença entre um resultado útil e uma perda de tempo. O procedimento padrão envolve três elementos principais: o meio de cultura, a fonte de inóculo e as condições de incubação. O meio mais comum para trabalho geral é o nutriente agar ou o Luria-Bertani (LB), que fornecem os nutrientes básicos para crescimento bacteriano. A escolha do meio vai depender do organismo que você está trabalhando.

um cientista cultiva uma colonia de bacterias: o que você precisa saber

Comece com a preparação do meio. Se você for fazer o seu próprio, pese 25g de caldo nutritivo por litro de água destilada, dissolva completamente e autoclave a 121°C por 15 minutos. Deixe esfriar até cerca de 50°C antes de despejar nas placas de Petri estéril. Cada placa recebe aproximadamente 20ml. Espere solidificar completamente antes de usar, o que leva cerca de 30 minutos em temperatura ambiente. A parte do inóculo é onde muita gente erra. Pegue uma colônia isolada de uma placa anterior usando uma alça de platina esterilizada. O ideal é tocar apenas a borda da colônia, não o centro, porque as bactérias mais ativas estão nas bordas. Espalhe suavemente na superfície de uma nova placa usando o método de streaking em quatro quadrantes. O objetivo é diluir gradualmente as bactérias ao longo das quatro seções, até que no último quadrante as células estejam tão espaçadas que cada uma cresça formando uma colônia individual.

Incube as placas invertidas a 37°C por 18 a 24 horas. Inverter as placas é importante porque evita que gotas de condensação caiam sobre as colônias e espalhem o crescimento de forma irregular. Se você deixar as placas de cabeça para baixo, vai notar diferenças imediatas na qualidade do crescimento. Tive um problema específico há uns meses com contaminação fúngica em placas que pareciam estar funcionando perfeitamente. As colônias bacterianas cresciam normalmente, mas após 48 horas apareciam manchas esverdeadas com hifas visíveis. O problema era que o fluxo de ar no gabinete de fluxo laminar estava desregulado. Troquei a pré-filtração e fiz uma vistoria na ventilação, mas a solução prática que adotei foi passar a usar antibióticos no meio quando sabia que o risco de contaminação fúngica era alto, especificamente anfotericina B a 2,5g/ml. Isso não interfere no crescimento bacteriano e elimina a maior parte dos fungos contaminantes.

Existem coisas que os manuais não destacam muito. Uma delas é que a densidade do inóculo original importa mais do que parece. Se você pegar uma colônia muito velha, com mais de 48 horas, a viabilidade cai drasticamente e o streaking demora mais para gerar colônias isoladas. Outro ponto: a umidade do meio. Meios muito secos, com placas guardadas há mais de duas semanas mesmo bem vedadas, prejudicam o crescimento de organismos mais sensíveis como Haemophilus ou Neisseria. Para esses casos, incubação em atmosfera úmida com dishes selados em sacos plásticos com uma pequena quantidade de água estéril no fundo faz diferença significativa. O principal limitação do método clássico de streaking em placa é que ele só funciona bem para bactérias que crescem rapidamente em meios ricos. Organismos de crescimento lento, como Mycobacterium tuberculosis, exigem tempos de incubação de semanas e meios específicos como o Lowenstein-Jensen. Para fungos filamentosos, o método de spread ou o de spot em linha podem ser mais adequados do que o streaking tradicional. Também não é recomendável usar esse procedimento para bactérias anaeróbias estritas, que precisam de condições de redução de potencial redox específicas que uma placa aberta não proporciona.

Se o seu objetivo é quantificar bactérias e não apenas isolar colônias, aí o caminho é usar o método de serial diluição e plaqueamento em série, calculando as UFC por mililitro a partir das placas que apresentarem entre 30 e 300 colônias. Esse número entre 30 e 300 não é arbitrário — colônias abaixo de 30 têm variabilidade estatística alta, e acima de 300 há risco de sobreposição que impede a contagem precisa. Armazenamento das placas preparadas deve ser feito a 4°C em sacos plásticos selados, e o uso deve ocorrer dentro de duas semanas para a maioria dos meios. Meios selecionativos com antibióticos perdem eficácia após esse período. Já as estirpes bacterianas para uso futuro vão melhor congeladas a -80°C em caldo de cultura com 15 a 20% de glicerol como crioprotetor. O ciclo de descongelamento e recongelamento repeatedly prejudica a viabilidade, então o ideal é trabalhar com aliquotas únicas desde o início.